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1.
为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR) 从弓形虫RH 株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性. 相似文献
2.
为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与GenBank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性. 相似文献
3.
采用PCR方法扩增对虾白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因,插入到pGEX-4T-2表达载体上构建出带有目的基因的重组质粒pGEX-4T-2RR,然后将重组质粒转化大肠杆菌.转化菌经IPTG诱导后大量表达重组蛋白,通过降低诱导温度获得可溶性表达的重组蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白. 相似文献
4.
《实验室研究与探索》2018,(11)
以GST-AQP7(Aquaporin 7)融合蛋白的原核表达为例,进行了生物学开放性实验教学的实践与探讨。利用PCR技术快速扩增小鼠AQP7-C末端亲水性肽段区基因片段,构建重组表达载体pGEX-4T-1∕AQP7,转化表达菌株E. coli BL21,诱导表达GST-AQP7融合蛋白,并对目的蛋白亲和层析纯化。PCR鉴定和DNA测序结果表明,pGEX-4T-1∕AQP7重组表达载体构建正确,SDS-PAGE蛋白电泳结果证实GST-AQP7高效表达并成功纯化。经过上述实验过程,学生系统掌握了从基因操作到蛋白表达一系列基本的分子生物学实验技能,很好地将课本所学理论知识应用于实验研究,提高了学生的综合科研素质,激发了学生的实验热情。 相似文献
5.
通过PCR技术扩增出人铁蛋白基因,经酶切后与表达载体质粒pGEX-4T-2连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌,利用菌落PCR、质粒双酶切、测序,证实成功地构建了人铁蛋白基因表达载体,利用IPTG对重组菌进行诱导表达,通过尿素洗涤纯化目的蛋白用于制备抗体． 相似文献
6.
利用PCR技术从肝素黄杆菌克隆到肝素酶HepI基因,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coliBL21感受态细胞,获得基因工程重组菌．12℃下IPTG诱导表达12h,Glutathione Sepharose 4B纯化后获得较高纯度的HepI酶蛋白． 相似文献
7.
利用RT—PCR技术从HEK293细胞中克隆到人Rab7基因,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coliDH5α感受态细胞,获得阳性克隆．24℃下IPTG诱导表达,Glutathi—one Sepharose 4B纯化后获得高纯度的Rab7蛋白．并以此为抗原免疫小白鼠,获得了Rab7的特异性抗体． 相似文献
8.
利用RT-PCR技术从日本对虾中克隆到β-actin基因的cDNA,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,获得阳性克隆.4℃下IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B纯化后获得高纯度的β-actin蛋白.① 相似文献
9.
以对虾白斑病毒DNA为模板扩增出Vp28基因,经限制性内切酶（SmaI,Not I）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Vp28基因原核表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约52kD相吻合的融合蛋白带,18℃诱导24h后获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白． 相似文献
10.
以凡纳滨对虾为研究对象,通过RT-PCR技术扩增出铁蛋白（Ferritin）基因,经特定的酶切（Notl,Smal）后插入到表达质粒pGEX-4T-2上构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌．经菌落PCR和质粒双酶切鉴定确认,证实成功地构建了对虾铁蛋白基因的原核表达载体．再对重组菌用IPTG诱导表达,采用Glutathione Sepharose4B亲和层析得到目的蛋白用于制备抗体,为研究铁蛋白在对虾抗病毒免疫中的作用奠定基础． 相似文献
11.
从人直肠癌细胞株Colo320中提取总RNA,经RT-PCR扩增出SOD基因片段,经限制性内切酶（BamHI,Sinai）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了人SOD基因融合表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约44kD相吻合的融合蛋白带,获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepha—rose4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白． 相似文献
12.
从水生植物凤眼莲叶片中提取总 RNA,经 RT-PCR扩增出Ca2＋-ATPase基因片段,经限制性内切酶(Sma I,Not I)酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了Ca2＋-ATPase基因融合表达载体,．转化菌经IPTG诱导表达,获得了大小约48 kD的可溶性目的蛋白,与预期相吻合．利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Gluta-thione Sepharose 4B)亲和介质对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白． 相似文献
13.
苦瓜作为药食同源的植物,含有许多活性成分,其中核糖体失活蛋白MAP30是近年来研究较多的一种.根据G enbank中MAP30序列,采用PCR技术,从苦瓜基因组DNA中扩增出该基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-28a上,构建重组质粒pET-MAP30,经克隆载体转化菌液PCR鉴定,结果显示成功构建MAP30的原核表达载体. 相似文献
14.
饱和苯酚氯仿法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR法扩增编码β-淀粉样蛋白的目的基因,利用基因克隆技术构建以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体pcDNA3.1-Aβ42×2,应用酶切及测序鉴定表达载体.相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段(为269bp),测序未发现突变,表达载体构建成功. 相似文献
15.
介绍了以拟南芥PKS5蛋白激酶在大肠杆菌中的克隆及表达实验为蓝本,进行分子生物学实验教学模式改革。实验提取了拟南芥基因组DNA,并以此为模板用PCR法扩增出PKS5蛋白激酶基因,以pGEX-6P-1质粒为载体,构建pGEX重组质粒并将其转入大肠杆菌BL21中,筛选阳性重组子,用IPTG诱导pGEX重组子表达PKS5蛋白,最终通过SDS-PAGE检测得到约73 KDa的GST-PKS5融合蛋白。学生通过完成上述实验过程,有利于将其所学理论知识应用于实验,形成清晰完整的实验思路。 相似文献
16.
用PCR方法从地衣芽孢杆菌WH-08基因组DNA中分别扩增α-淀粉酶基因amyL启动子PamyL和终止子TT,用重叠PCR技术将两者连接,重叠PCR产物用Hind III和EcoR I双酶切后,与经相同酶切的载体PHY300 PLK连接,构建重组质粒PHY-PamyL-TT。该重组载体的构建为外源蛋白在地衣芽孢杆菌中的高效表达奠定了基础。 相似文献
17.
目的:确定猪圆环病毒2型衣壳蛋白(PCV2)感染引起未折叠蛋白反应的关键病毒蛋白,以及探究PCV2感染中未折叠蛋白反应与凋亡之间的联系。创新点:本文首次鉴定出PCV2感染引起未折叠蛋白反应的关键病毒蛋白。方法:构建表达病毒蛋白的真核表达载体,通过瞬时转染PK-15细胞,采用免疫印迹检测未折叠蛋白反应通路的关键分子;利用RNA干扰抑制perk基因的表达来验证激活的通路;通过抑制内质网上游分子PERK并利用免疫印迹和流式细胞术检测凋亡,研究内质网应激与凋亡之间的联系。结论:PCV2 Rep和Cap蛋白能激活PERK-e IF2α-ATF4-CHOP通路,PERK通路在Cap诱导的细胞凋亡中起重要作用。 相似文献
18.
目的:在大肠杆菌(BL21)中构建可溶性表达的金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)受体拮抗剂。方法:首先确定SEB受体桔抗剂的基因序列,然后用含有SEB受体桔抗剂的基因序列重组质粒表达载体PGEX-4T-1转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达获得蛋白,产物经GST柱纯化后,利用ELISA检测其与SEB的结合能力并进行其体内外药效学实验。结果:该质粒成功转化为可溶性表达,ELISA结果显示表达产物可与SEB特异性结合。结论:本研究成功对SEB受体拮抗剂GST可溶性表达并对其活性进行初步分析。 相似文献
19.
《赣南师范学院学报》2020,(6):87-93
生物体内的铁蛋白Ferritin在储存和释放铁离子、抗氧化胁迫和病菌侵染过程中发挥着重要作用.为探索玉带凤蝶(Papilio polytes)铁蛋白的功能,本研究开展了对玉带凤蝶铁蛋白亚基的鉴定,分析其组织表达谱和铁离子胁迫下的表达水平.基于玉带凤蝶基因组数据库,鉴定了铁蛋白轻链亚基(PpFerLCH)和重链亚基(PpFerHCH)基因并且克隆出2个基因的开放阅读框(ORF);利用生物信息学,对其结构域以及与其他物种的进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR技术分析两个亚基在不同组织以及铁离子胁迫下的表达水平.玉带凤蝶PpFerLCH基因cDNA全长为1207 bp,其开放阅读框为696 bp,编码231个氨基酸,预测其蛋白分子量为26.5 kDa,理论等电点为5.64;PpFerHCH基因cDNA全长为1 300 bp,ORF为636 bp,编码211个氨基酸,预测其蛋白分子量为23.7 kDa,理论等电点为6.53.结构域分析显示PpFerLCH和PpFerHCH都含有一个保守的铁蛋白结构域,而PpFerHCH具有Ferrihydrite nucleation center.系统发育树分析揭示PpFerLCH主要与烟草天蛾(Manduca sexta)以及大蜡螟(Galleria mellonella)铁蛋白重链亚基保持较高的同源性,而PpFerHCH与烟草天蛾具有较近的亲缘关系.实时荧光定量PCR分析表明PpFerLCH和PpFerHCH在玉带凤蝶的中肠和马氏管中表达量较高,而在其他组织表达量相对较低.此外,FeCl_3刺激24以后,PpFerLCH和PpFerHCH能够被显著诱导上调表达.本研究为进一步研究玉带凤蝶铁蛋白的功能奠定基础. 相似文献
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采用PCR方法克隆获得拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因成熟肽片段,将其连接到Pichia pastoris酵母表达载体pPIC9K中,构建了分泌表达载体pPICgk-Scy．电击转化毕赤酵母GS115,经表型筛选和PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合人酵母基因组中．以甲醇诱导表达阳性克隆,上清中表达产物经过Tricine-SDS-PAGE鉴定与预期的目的蛋白大小（约10ku）相符．并利用琼脂孔穴扩散法证明了表达产物能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长． 相似文献