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1.
采用PCR方法扩增对虾白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因,插入到pGEX-4T-2表达载体上构建出带有目的基因的重组质粒pGEX-4T-2RR,然后将重组质粒转化大肠杆菌.转化菌经IPTG诱导后大量表达重组蛋白,通过降低诱导温度获得可溶性表达的重组蛋白,采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白. 相似文献
2.
克隆、构建弹状胭脂鱼弹状病毒糖蛋白基因重组质粒,并进行表达和鉴定.用RT-PCR方法扩增出大小为1.5kb的CSRV-G基因片断,构建重组克隆质粒pRSET-C/CSRV-G,并将其转化进入大肠杆菌DH5α原核表达系统,酶切鉴定证明重组质粒的正确性.经IPTG诱导后表达重组蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行分析鉴定,诱导后能够表达预期的分子量为55 kD的融合蛋白. 相似文献
3.
目的获得重组TsARG2基因蛋白,为进一步研究其功能和制备特异抗体奠定基础.方法根据已报道的TsARG2基因序列,采用RT-PCR的方法获得TsARG2基因.将所得的PCR产物插入原核表达载体pQE30中,得重组质粒(pQE/TSARG2)并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱导表达出带有六个组氨酸的融合蛋白,采用镍固定金属亲和层析法纯化.结果序列分析表明TSARG2基因成熟肽编码区含有918bp,编码305个氨基酸;与GenBank(AY040204)中已报道的TSARG2分离物的核苷酸序列有100%同源性.经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的66%,分子质量约为35kDa.经Ni2 -NTAagarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带.结论在大肠杆菌中获得了TsARG2基因蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础. 相似文献
4.
绿僵菌是一类广泛应用于生物防治的昆虫病原真菌.研究表明小RNA能够调控基因的表达,其中Argonaute基因在整个小RNA通路中发挥重要的作用.本研究通过RT-PCR的方法从绿僵菌中获得了Argonaute基因的部分功能片段,构建了其重组原核表达载体,将重组载体转化至大肠杆菌进行诱导表达;采用镍柱亲和纯化重组的目的蛋白并通过Western blot技术鉴定.结果发现：通过RT-PCR的方法获得长度约为950bp的基因片段;重组原核表达载体经诱导表达后,SDS-PAGE检测发现分子量约为34kDa的目的蛋白条带;诱导5h后蛋白的表达量最高,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,经Western blot技术检测,重组蛋白可与His-tag抗体发生特异性反应.该纯化重组蛋白的获得为将来绿僵菌Argonaute蛋白抗体的制备,并进一步通过该抗体获得绿僵菌体内的小RNA及其靶基因提供了基础. 相似文献
5.
为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR) 从弓形虫RH 株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性. 相似文献
6.
为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与GenBank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性. 相似文献
7.
利用PCR技术从肝素黄杆菌克隆到肝素酶HepI基因,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coliBL21感受态细胞,获得基因工程重组菌．12℃下IPTG诱导表达12h,Glutathione Sepharose 4B纯化后获得较高纯度的HepI酶蛋白． 相似文献
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9.
目的:构建唾液抗菌肽P113基因多拷贝串联重组体,并将其克隆到表达载体pET-28a.方法:根据大肠杆菌偏爱的密码子设计并合成人唾液抗菌肽P113基因,采用PCR技术构建P113基因的自融合多拷贝串联重组体polyP113,BAMH I和HindⅢ双酶切表达载体pET-28a和polyP113基因,将两者连接后转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选阳性菌落,PCR、酶切、测序鉴定重组质粒.结果:所构建的含有十拷贝P113基因的重组体正确克隆到表达载体pET-28a上,无突变.结论:成功构建含十拷贝唾液抗菌肽P113基因表达框的大肠杆菌表达载体. 相似文献
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《学周刊C版》2017,(16):25-26
目的:观察探讨C35在肝癌中的表达与靶向干预,为临床治疗提供依据。方法:设计两对C35编码区的si RNA并合成,构建到转录载体p TZU6+1上,形成重组质粒siRNA-C35,在脂质体介导下转染肝癌细胞株,RT-PCR分析RNA干扰后mRNA的变化,Western blot检测表达蛋白的变化。结果:扩增的目的基因条带亮度存在明显差异,与对照组相比,转染质粒pTZU6+1相对表达率为95.3%、siRNA1组相对表达率为40.0%,siRNA2组的相对表达率为28.4%。构建的重组质粒对C35mRNA的表达有抑制作用。只转染脂质体组和pTZU6+1的C35蛋白杂交带强于siRNA1和siRNA2,证实重组质粒可以抑制C35基因的表达,以对照组的蛋白带为标准,其图像分析可知,转染质粒pTZU6+1相对表达率为94.9%、siRNA1组相对表达率为29.6%,siRNA2组的相对表达率为32.2%。结论:通过设计C35基因敲除的si RNA可有效抑制C35基因的表达,肝癌细胞生长速度及侵袭性均发生改变,但C35基因在肝癌细胞株中及肝癌组织中低表达,不可作为肝癌的靶点干预基因。 相似文献
11.
将斑节对虾酚氧化酶原（prophenoloxidase,proPO）基因克隆进pET28a（＋）,在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析均能检测到一条分子量为79．4kDa的特异性条带,与推导的融合蛋白理论分子量82．4kDa基本相符;包涵体变性后对经Ni—NTAagarose纯化的变性液进行复性,表现出0．3851U／mg．min的PO活性;不同条件下的诱导表达结果显示,18℃时诱导培养能检测到目的蛋白的可溶性表达,经诱导9h后可溶性表达比例达到最高,约占菌体可溶性蛋白总量的s．56％;可溶性表达的目的蛋白纯化后经胰酶消化,可检测到分子量为60kDa、42．7kDa的特异性条带,并表现出0．4249U／mg．min的PO活性． 相似文献
12.
通过PCR技术扩增出人铁蛋白基因,经酶切后与表达载体质粒pGEX-4T-2连接,重组质粒转化感受态大肠杆菌,利用菌落PCR、质粒双酶切、测序,证实成功地构建了人铁蛋白基因表达载体,利用IPTG对重组菌进行诱导表达,通过尿素洗涤纯化目的蛋白用于制备抗体． 相似文献
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壳聚糖及其单体体外抑菌作用研究 总被引：9，自引：1，他引：9
[目的]主要研究食品级壳聚糖、水溶性壳聚糖、N 乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖硫酸氯化钾复盐的抑菌作用 [方法]利用纸片琼脂扩散法(K B法)观察对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、新型隐球菌有无抑菌作用,利用试管稀释法对有抑菌作用壳聚糖进行最小抑菌浓度(MIC)的测定 [结果]N 乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖硫酸氯化钾复盐无抑菌作用,食品级壳聚糖、水溶性壳聚糖有抑菌作用;食品级壳聚糖对大肠杆菌的MIC为2.5%,而对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、新型隐球菌的MIC为1.25%;水溶性壳聚糖对大肠杆菌的MIC为1.25%,而对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、新型隐球菌的MIC为0.625% [结论]氨基单糖及盐无抑菌作用,壳聚糖有一定的抑菌作用,而且低分子壳聚糖比高分子壳聚糖的抑菌活性强 相似文献
15.
INTRODUCTION b-1,4-galactosyltransferase (b4Gal-T) (EC 2.4.1.38), as one of the most researched glycosyl-transferases in recent years, produces a b-1,4-linked galactosylated glycan by the transferation of ga-lactose (Gal) from an uridine diphosphate-galactose (UDP-Gal) to a monosaccharide N-acetylglucosa- mine (GlcNAc) or a GlcNAc residue located in the non-reducing terminal of glycans of glycoproteins or glycolipids. In addition to GlcNAc, the enzyme can also use other reducing su… 相似文献
16.
本研究对大肠杆菌进行紫外照射诱变后,获得了通过其内部的SOS修复系统产生的突变菌株,采用异丙醇沉淀法对各组菌种进行质粒DNA提取.通过测定各组OD值,经过比较与分析得出了经紫外处理10min后的大肠杆菌质粒DNA浓度最高,为215ug/ml,其次为正常组的190ug/ml.经紫外照射30min后的大肠杆菌质粒DNA浓度最低,仅为65ug/ml.紫外处理时间与质粒DNA浓度整体呈现下降趋势.初步推测是由于大肠杆菌SOS修复系统的RecA蛋白促进了不完全同源的DNA序列之间的重组,产生大量的错配碱基,从而引起突变,进而影响到其质粒DNA的浓度. 相似文献
17.
Xiao-ying Wang Zhong-hua Chen Ru-yi Zhang Sen-quan Liu Zhu Mei Ying-ying Yu Xiong Zhang Qiang Xia Yue-min Ding 《Journal of Zhejiang University. Science. B》2012,13(5):356-363
Objective
Bone morphogenetic proteins (BMPs) are known to play an important role in bone and cartilage development. Recent research has shown that BMPs may induce tumorigenesis and promote tumor to spread, but the molecular mechanisms have not been elucidated. The aim of the present study was to investigate the regulatory function of BMP-2 in the migration of COS-7 cells and the underlying mechanisms. 相似文献18.
孙晓东 《陕西教育学院学报》2010,26(2):106-107,121
为了构建人C6orf210基因原核表达载体,并在E．coliBL21中表达并纯化。采用RT—PCR扩增人C6orf210基因片段,并将其克隆到原核表达载体Pet21a中,构建重组质粒pET21a—C6ort210。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E．coliBL21,经IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示获得全长为1188bp的人的CAiorf210基因片段。以构建的重组质粒pET21a—C6orf210转化E．coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约66000的融合蛋白。经SINS—PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为C6orf210。 相似文献
19.
Liu F Zhong H Liang JY Fu P Luo ZJ Zhou L Gou R Huang J 《Journal of Zhejiang University. Science. B》2010,11(12):905-911
In this paper,we investigate the effect and the possible mechanism of high glucose levels on the calcification of human aortic smooth muscle cells (HASMCs).HASMCs were divided into four groups: normal glucose group (NG),osmolality control group (OC),high glucose group (HG,HASMCs culture medium containing 30 mmol/L glucose),and high glucose plus recombinant human Noggin protein (bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) antagonist) group (HN).The mRNA levels and the protein expressions of BMP-2 and core binding factor alpha-1 (Cbfα-1) were measured by real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) and Western blot.After induced by 10 mmol/L β-glycerol phosphoric acid,cells were harvested for assessments of alkaline phosphatase (ALP) activities at Days 1,2,and 3,and intracellular calcium contents at Days 7 and 14,respectively.High glucose levels increased the mRNA levels and the protein expressions of BMP-2 and Cbfα-1 (P0.05).The expression of Cbfα-1 was partially blocked by Noggin protein (P0.05),while BMP-2 was not (P0.05).After being induced by β-glycerol phosphoric acid,high glucose levels increased the ALP activity [(48.63±1.03) vs.(41.42±2.28) U/mg protein,Day 3;P0.05] and the intracellular calcium content [(2.76±0.09) vs.(1.75±0.07) μmol/mg protein,Day 14;P0.05] in a time-dependent manner when compared with the NG group,while the ALP activity could not be blocked by Noggin protein [(48.63±1.03) vs.(47.37±0.97) U/mg protein,Day 3;P0.05].These results show that high glucose levels can evoke the calcification of HASMCs by inducing osteoblastic trans-differentiation and intracellular calcium deposition via the BMP-2/Cbfα-1 pathway,which can be partially blocked by Noggin protein. 相似文献