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1.
为建立快速诊断小鹅瘟的PCR方法,根据已发表的GPV主要结构蛋白VP3基因序列,经多序列比对和Oligo6．0软件分析设计特异性PCR引物。以微量法提取病鹅肝组织DNA,优化PCR反应引物退火温度、循环次数和鉴定其特异性,并与酚氯仿法和煮沸法进行同步对比研究。结果显示,建立的PCR检测方法能够特异性检测病鹅肝组织中GPV的核酸,其扩增片段大小为343bp,最佳退火温度为58℃,最佳循环次数为35次。微量法提取的病毒核酸PCR检测灵敏度分别是酚氯仿法的50倍和煮沸法的2500倍。该PCR检测方法不与鹅副黏病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、鸭瘟病毒以及健康鹅肝组织发生交叉反应。本研究建立的GPVPCR检测方法能够快速诊断小鹅瘟。 相似文献
2.
建立并优化虎耳草ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨虎耳草种质资源遗传多样性奠定基础.采用正交设计方法和单因子试验,研究TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg2+、引物、模板DNA、延伸时间及循环次数对PCR扩增的影响.结果表明:虎耳草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在25μL的反应体系中含模板DNA 35ng,Mg2+1.25mmo/lL、dNTP 380μmo/lL、引物1.2μmo/lL、Taq DNA聚合酶1.5U.反应程序为:95℃预变性5min;94℃变性1min,50℃(据不同引物的退火温度)退火70s,72℃延伸1.5min,40个循环;72℃延伸10min,4℃保存.经过11份虎耳草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于虎耳草种质资源遗传多样性分析及居群鉴别的研究. 相似文献
3.
以新疆哈密瓜为试验材料,利用正交试验设计研究了4个主要因子(Mg2+、DNA聚合酶、SSR引物和dNTP)对SSR扩增结果的影响,并对该哈密瓜SSR反应体系进行了优化,同时尝试用降落(Touchdown,TD)PCR方法扩增目的片段.最终筛选出如下最佳反应体系:总反应体积为25 μL,其中dNTP 200 μmol/L,SSR引物0.75μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,Mg2+ 1.5 mmol/L;降落PCR省却了常规PCR中摸索最适退火温度的过程,对一些Tm值相近的PCR反应可应用一套温度程序扩增,是一种行之有效的方法. 相似文献
4.
采集20例南阳牛的血液,采用酚/氯仿法分离白细胞提取基因组DNA,并且对ANGPTL4基因部分序列(677～998 bp)PCR扩增条件进行了优化。结果表明,获得的牛基因组DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,主条带清晰,表明获得的南阳牛基因组DNA可以用于后续实验;以所提取的基因组DNA为模板,优化ANGPTL4基因片段扩增的条件,结果表明,最理想的PCR扩增条件是模板量为2μL(50 mg/L),Taq聚合酶(5 u/μL)的量为0.8μL,退火温度为56℃,循环次数为35次。 相似文献
5.
胡桃楸ISSR-PCR反应体系的建立及优化 总被引：3，自引：0，他引：3
在研究胡桃楸遗传多样性的过程中,为了获得清晰、重复性好的ISSR扩增结果,采用改良的CTAB法提取胡桃楸基因组DNA,利用正交设计与单因子试验相结合的方法对影响胡桃楸ISSR-PCR反应体系的5个主要因素(Taq酶、Mg~(2+)、dNTP、引物、模板DNA)在4个水平上进行优化设计。通过综合比较分析,筛选出各反应因素的最佳水平,建立胡桃楸ISSR-PCR最佳反应体系:20μL的反应体系中,Taq酶1.0 U,Mg~(2+)2.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,模板DNA 50～250 ng,引物0.4μmol/L。在此基础上筛选出13条多态性好、扩增稳定的ISSR引物,并确立了最佳退火温度和循环次数。这一优化系统的建立为今后利用ISSR技术进行胡桃楸遗传多样性、亲缘关系以及物种保护等的研究奠定了基础。 相似文献
6.
都支杜鹃ISSR扩增条件的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
对珍稀濒危物种都支杜鹃的ISSR扩增体系中的Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量和底物含量进行优化,并在优化后的基础上筛选出8条效果较好的引物,在梯度PCR仪中设置温度梯度,找到这些引物的最佳退火温度。优化结果表明,至少在一定的范围内底物浓度和Taq酶含量对PCR反应结果影响不大,相对而言,dNTP浓度和Mg2+浓度对反应结果的影响更加显著。优化后的15 ul PCR反应体系中包括20 ng模板DNA、0.3μM引物、1.5 ul Buffer(Mg2+free),0.5 U Taq酶、1.5 mM MgCl2和0.1 mM dNTP。 相似文献
7.
以渐危植物海菜花基因组DNA为研究对象,筛选引物UBC-818[序列为(CA)8G]研究并确定了该引物适宜的退火温度,对影响ISSR扩增效果的主要参数进行筛选和优化,确定了海菜花的ISSR分析的最佳反应体系:15 μL反应体系中含25 ng模板DNA,0.2 mmol·L-1引物,0.2 μmol·L-1 dNTPs,2.0mmol·L-1 Mg2+ ,0.5 UTaq酶,1.5 μL 10×PCR Buffer Mg2+(-)[100 mmol·L-1 Tris-HCI(pH 8.3),500 mmol.L-1KCI]. 相似文献
8.
小麦基因组DNA提取方法比较研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用4种方法对小麦基因组DNA进行提取,采用琼脂糖凝胶电泳法和核酸蛋白分析仪比较DNA的浓度和质量,结果显示,4种DNA提取方法在DNA浓度上有所差别,方法一所提取的DNA浓度最高,但消耗试剂最多;方法二所提取的DNA浓度最低,有蛋白质污染,但过程简单;方法三和方法四所提取的DNA浓度相当,方法三有蛋白质污染,过程简单,方法四纯度高,过程最复杂.采用同一对引物和反应体系对所提取的DNA进行PCR扩增,结果显示4种方法所提取的基因组DNA均能满足分子标记检测的需要. 相似文献
9.
使用中的聚合酶链式反应仪的温度分布及维护 总被引：3，自引：0，他引：3
娄沂春 《实验室研究与探索》2001,20(2):109-111
聚合酶链式反应仪（PCR仪）是分子生物学的基本仪器。它通过设定不同温度变化条件对被扩增的DNA片段进行变性、退火和聚合处理，以达到将DNA片段的量成倍地扩增的目的。因此温度的分布和准确程度，尤其是各个温度的时间控制直接影响DNA片段扩增的效率。通过定期对使用中的PCR仪进行检测，可以了解仪器的工作状况，及时发现问题并加以维护、保养。 相似文献
10.
目的:介绍一种快速简便地优化多重PCR检测DMD基因外显子缺失的方法及详细步骤.方法:采2ml外周血,用0.2%氯化钠处理收集白细胞,再用基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA,用优化的多重PCR法直接检测DMD基因外显子的缺失.结果:用该方法检测DMD基因外显子缺失结果准确清晰.结论:用优化的多重PCR技术可以直接检测DMD基因外显子缺失,跟通常使用的9对引物一步法相比,具有经济、快速、简便等特点. 相似文献