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1.
简并PCR法克隆L.starkeyi苹果酸酶基因 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已报道的酵母苹果酸酶基因序列,利用CodeHop（Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers）软件设计两对简并引物,以斯达油脂酵母（L.starkeyi CICC 1809）总DNA为模板做简并PCR,得到2个基因片段（ME1,ME2）.对这2个目的片段进行测序,将结果翻译成氨基酸序列,blastp结果显示其中ME2片段为油脂酵母未报道苹果酸酶基因的序列（Gene Bank登录号GU348991）,并对巢式PCR方法检验简并PCR结果的有效性进行了评估. 相似文献
2.
以拟南芥为材料,对热激蛋白HSP70基因片段进行了克隆研究,获得了最佳的分子克隆实验体系．首先提取拟南芥总DNA,接着在热激蛋白HSP70编码区设计引物,扩增出HSP70编码区的片断,再将HSP70编码区的片断加上具有EcoRⅠ酶切位点双链的人工接头,通过EcoRⅠ对其进行酶切．再与经过EcoRⅠ酶切并已经去磷酸化的PUC19载体通过T4连接酶进行连接,然后将连接产物置人到感受态大肠杆菌细胞中（即转化）,并让这种细胞在含有Amp＋／IPTG／X—Gal的LB培养基上生长．挑取培养基上蓝白斑中的白斑,进行质粒DNA提取,通过酶切质粒DNA,从而初步判断目的片段已被克隆． 相似文献
3.
饱和苯酚氯仿法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR法扩增编码β-淀粉样蛋白的目的基因,利用基因克隆技术构建以β-淀粉样蛋白为靶的表达载体pcDNA3.1-Aβ42×2,应用酶切及测序鉴定表达载体.相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段(为269bp),测序未发现突变,表达载体构建成功. 相似文献
4.
根据GenBank发布的基因序列,设计PCR引物,分别从诸葛菜(Orychophragmus violaceus)的花瓣基因组DNA和cDNA克隆到查尔酮合成酶基因,并定名为OvCHS,序列已上传至NCBI数据库,登陆号为EF408918。序列分析表明,OvCHS基因的基因组全长为1263 bp,具一个75 bp的内含子,编码区全长为1188 bp,编码395个氨基酸。与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)查尔酮合成酶基因AtCHS比较发现,两基因编码区有135个碱基不同,相似性为88.64%,氨基酸序列中仅16个氨基酸残基的差异,相似性达95.95%。 相似文献
5.
根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该1条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明：该基因为放线菌来源chs基因．分别在该基因5＇末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoRI酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple—T／chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点（PI）为5．41、分子量为3965道尔顿含有cHs保守功能区的酸性蛋白质．分析表明,该基因与Streptomyceslividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87．70％．测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中． 相似文献
6.
根据GenBank数据库中猪圆环病毒Ⅱ型的基因组序列设计引物,采用PCR技术从病料基因组DNA中扩增出PCVⅡ河南地方株ORF4基因,全长180 bp,编码59个氨基酸.将该基因克隆至载体pGEX-4T-3中形成pGEX-4T-3-ORF4表达载体.经PCR、酶切和测序鉴定后,转化表达菌株BL21（DE3）诱导表达.SDS-PAGE结果显示：ORF4能够在大肠杆菌中表达,产物的分子量约为32 kD,且以包涵体形式存在.Western Blot检测结果显示,纯化后的ORF4蛋白能够与鼠抗6＆#215;His标签单克隆抗体发生特异性反应,为进一步研究PCVⅡORF4蛋白的特性与功能奠定了基础. 相似文献
7.
Bogdan Munteanu Mario Braun Kajohn Boonrod 《Journal of Zhejiang University. Science. B》2012,13(4):244-247
QuickChange mutagenesis is the method of choice for site-directed mutagenesis (SDM) of target sequences in a plasmid. It can
be applied successfully to small plasmids (up to 10 kb). However, this method cannot efficiently mutate bigger plasmids. Using
KOD Hot Start polymerase in combination with high performance liquid chromatography (HPLC) purified primers, we were able
to achieve SDM in big plasmids (up to 16 kb) involving not only a single base change but also multiple base changes. Moreover,
only six polymerase chain reaction (PCR) cycles and 0.5 μl of polymerase (instead of 18 PCR cycles and 1.0 μl of enzyme in
the standard protocol) were sufficient for the reaction. 相似文献
8.
采用三种不同的方法(质粒酶切、16S rRNA基因扩增酶切、ERIC-PCR)制备DNA样品,使教师可以根据自身的条件采取不同的方法进行实验准备。设计了通过DNA琼脂糖凝胶电泳的结果比较来找出罪犯的实验环节,从而使得该实验的准确性、重复性和吸引力大大提高。 相似文献
9.
10.
以pLF3为模板,PCR扩增得到葡聚糖酶的启动子,并将启动子基因重新连接到切除启动子基因及葡聚糖酶基因的pLF3载体上,构建pLF3-pro载体.采用PCR的方法扩增朱黄青霉总DNA中的α-1-6-葡聚糖酶基因,并插入到pLF3-pro载体上,构建pLF3-Pro-Dex质粒,以大肠杆菌DH5α为宿主菌,酶切验证及PCR验证均表明成功构建了pLF3-Pro-Dex质粒,且重组质粒中的α-1-6-葡聚糖酶基因与朱黄青霉中的α-1-6-葡聚糖酶基因有93%的同源性. 相似文献
11.
ZHANG Xiu-yan RUAN Hui MU Lin HE Guo-qing TANG Xing-jun CHEN Qi-he 《浙江大学学报(A卷英文版)》2006,7(11):1948-1955
INTRODUCTION Enzymes are efficient and specific biocatalysts widely used in food industries, but their application in industrial process often involves special properties not found in natural source enzymes. In order to ob- tain desirable enzymes, in the past ten years, scientists have developed rational (Kurth et al., 1998; Mouratou et al., 1999; DeSantis et al., 1999) and irrational de- sign methods (Babbitt and Gerlt, 1997; O’Brien and Herschlag, 1999) to improve the enzyme propert… 相似文献
12.
以高拷贝克隆载体pUC118为骨架载体,在pUC118质粒Amp~r基因的Eam11057酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam11051酶切位点,将一人工合成的具有两个Eam11051酶切位点的互补寡聚核苷酸链(两端具有BamHI接头)插入已封闭Eam1105I酶切位点的pUC118质粒的BamHI位点,构成新的克隆载体,此质粒命名为pUC118E,该载体经Eam11051酶切后,可产生3’端突出一个T碱基的T-vector,能与PCR产物直接连接,经转化大肠杆菌JM109证实,该改造过的pUC118质粒,仍可使宿主细胞具有氨苄抗性,可作为氨苄选择标记的克隆载体。 相似文献
13.
为建立快速诊断小鹅瘟的PCR方法,根据已发表的GPV主要结构蛋白VP3基因序列,经多序列比对和Oligo6．0软件分析设计特异性PCR引物。以微量法提取病鹅肝组织DNA,优化PCR反应引物退火温度、循环次数和鉴定其特异性,并与酚氯仿法和煮沸法进行同步对比研究。结果显示,建立的PCR检测方法能够特异性检测病鹅肝组织中GPV的核酸,其扩增片段大小为343bp,最佳退火温度为58℃,最佳循环次数为35次。微量法提取的病毒核酸PCR检测灵敏度分别是酚氯仿法的50倍和煮沸法的2500倍。该PCR检测方法不与鹅副黏病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、鸭瘟病毒以及健康鹅肝组织发生交叉反应。本研究建立的GPVPCR检测方法能够快速诊断小鹅瘟。 相似文献
14.
以龙竹和凤尾竹基因组DNA为模板,通过试验不同的退火温度、循环数、Mg2＋浓度及DMSO浓度,获得了16条龙竹和凤尾竹PpMADS1相似序列片段,并得出稳定扩增PpMADS1相似序列的条件.对获得的龙竹和凤尾竹PpMADS1相似序列进行序列分析,发现龙竹和凤尾竹PpMADS1相似序列可根据序列长度差异分成组I和组II,并对其推出的氨基酸序列进行分析,找到了保守的paleoAP1基序和KIII区保守的氨基酸残基,并据此认为龙竹和凤尾竹PpMADS1相似序列是AP1/SQUA亚家族成员. 相似文献
15.
根据GenBank发布的几丁质酶基因序列设计PCR引物,从叶片cDNA中克隆到了番茄几丁质酶基因,并命名为LeCHI,基因在NCBI中的登陆号为FJ849060。测序结果表明,LeCHI编码区全长为762 bp,编码253个氨基酸。RT-PCR检测表明,LeCHI基因在根、茎、叶和花蕾中均有表达。序列比对结果表明,LeCHI编码的氨基酸序列与同科的马铃薯、辣椒有较高的同源性。 相似文献
16.
Objective: To construct a eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 (-)-Humanin. Methods: The recombinant plasmid pGEMEX-1-Humanin was digested with restriction endonucleases BamH I and Hind III and the Humanin gene fragments, about 100 bp length, were obtained. Then the Humanin gene fragments were inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (-) and the recombinant plasmids pcDNA3, l(-)-Humanin were identified by sequencing. Results: Recombinant plasmid DNA successfully produced a band which had the same size as that of the Humanin positive control. The sequence of recombinant plasmids accorded with the Humnain gene sequence. Conclusions: A eukaryotic expression plasmid of Humanin was successfully constructed. 相似文献
17.
玉米大斑病是玉米生产上的重要病害,分离和纯化玉米大斑病菌 STK1基因对于研究其致病性具有重要意义.根据 STK1基因 cDNA 序列设计特异性引物,以玉米大斑病菌基因组 DNA 为模板扩增得到 STK1基因 DNA 片段.该基因片段的分离和纯化,为进一步获得 STK1的完整基因,进行基因结构分析和该基因的突变体构建奠定了良好的基础. 相似文献
18.
目的：构建福氏志贺菌重组双歧杆菌Bb-ipaB疫苗。方法：以福氏志贺菌DNA为模板扩增福氏志贺菌ipaB基因,双酶切后克隆到pGEX-1λT质粒上,构建重组质粒pGEX-ipaB,电穿孔法将该质粒转化入Bb,构建福氏志贺菌重组Bb-ipaB疫苗。结果：成功扩增出分子量约为1 711 bp的ipaB基因,双酶切证实基因成功插入pGEX-1λT中,并成功转化入双歧杆菌,构建rBb-ipaB疫苗。结论：成功构建福氏志贺菌重组rBb-ipaB疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定了基础。 相似文献
19.
目的:建立猴源溶组织内阿米巴原虫巢式PCR检测方法并初步应用于临床检测;方法:根据溶组织内阿米巴原虫16S r DNA基因序列,设计1对阿米巴属原虫保守引物和1对溶组织内阿米巴原虫特异性引物,建立猴源溶组织内阿米巴原虫巢式PCR检测方法,摸索出了该检测方法的最佳反应条件,进了行特异性和敏感性试验,并对96份猕猴粪便样品进行检测;结果:该巢式PCR方法能特异性地扩增出猴源溶组织内阿米巴原虫目的片段,与莫氏内阿米巴、波氏内阿米巴、迪斯帕内阿米巴、大肠内阿米巴、微小隐孢子虫等11种相关原虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到0.3 fg的阳性参照DNA;对临床样品检测结果表明该PCR技术检查阳性者显微镜检查均为阳性;结论:建立的巢式PCR方法具有高度的特异性和敏感性,对于溶组织内阿米巴原虫病的诊断和流行病学调查具有重要的应用价值。 相似文献
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利用常规病毒分离方法，自死亡病人肺组织病料剖检样品中成功分离到了强致病性SARS-Coy肺组织毒。根据已发表的SARS-Coy Tor2株序列，设计并合成了38条覆盖全长基因组的PCR引物。应用RT-PCR技术从实验感染的Vero E6细胞上清中成功地扩增出了各相应的cDNA重叠片段，分别克隆至pGEM-T载体后，构建了SARS-Coy肺组织毒全基因组cDNA文库。SARS-Coy肺组织毒全基因组cDNA文库的构建为进一步研究SARS-Coy的分子生物学特性奠定了基础。 相似文献