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1.
抑癌基因PTEN载体构建及在LOVO细胞中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
目的:构建抑癌基因PTEN的表达载体并在LOVO细胞中表达。方法:从人外周血中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出PTEN基因片段,将PTEN基因连入pLenti6/V5载体。测序鉴定后,经脂质体转染入LOVO细胞,对细胞株进行RT-PCR和Western blot检测。结果:DNA测序证实pLenti6/V5-PTEN表达载体为阳性克隆;该表达载体转染LOVO细胞后上调了PTEN mRNA和蛋白的表达。结论:成功构建了pLen-ti6/V5-PTEN表达载体,为进一步研究PTEN在LOVO细胞中的功能奠定了基础。 相似文献
2.
在人体内,CCR5与许多免疫疾病有关,CCR5有望成为众多药物的作用靶点。将ccr5基因与真核表达载体pBBS242构建成重组质粒pBBS242-ccr5,转染CHO细胞,并经潮霉素B筛选。流式细胞仪检测结果表明CCR5在CHO细胞得到了稳定表达。 相似文献
3.
目的从昆明鼠睾丸中克隆Bmi1基因,构建真核表达载体,并转染支持细胞,以便用作培养精原干细胞（SSCs）的滋养层.方法以5日龄昆明鼠为材料,提取小鼠睾丸组织中总RNA后,以RT-PCR技术克隆小鼠睾丸Bmi1基因,构建真核表达载体,并转染TM4细胞（睾丸支持细胞株）,在转染后40 h进行免疫荧光鉴定.结果成功克隆小鼠睾丸Bmi1基因的cDNA,测序正确;免疫荧光细胞染色显示,转染后的支持细胞中有Bmi1蛋白表达.结论本研究为以转染了Bmi1基因的支持细胞作饲养层培养SSCs奠定了基础. 相似文献
4.
《大连大学学报》2016,(6):62-65
本实验旨在构建人核糖核酸酶抑制因子稳定干涉载体pLKO.1-ds RI,为后续观测人核糖核酸酶抑制因子干涉载体的表达对肿瘤细胞的影响奠定基础。用亚克隆法,将针对人核糖核酸酶抑制因子的干涉片段从Simple T-ds RI质粒克隆到pLK-0.1-TRC质粒,用酶切法筛选得到阳性重组质粒pLKO.1-ds RI,用测序法鉴定克隆序列正确。转染时设干扰组、空载体组和空白组三组,每组三次重复。用脂质体CellfectinR将pLKO.1-ds RI(干扰组)、pLKO.1-TRC(空载体组)转染进人肝癌细胞HepG2细胞中,未处理的细胞作空白组。转染后72hr用Western blotting检测细胞中核糖核酸酶抑制因子表达的变化。双酶切鉴定及测序鉴定结果均正确;Western blotting结果表明,对比空白组(1.1578±0.015)和空载体组(1.1216±0.027),干扰组RI表达(0.6119±0.048)明显下调(P<0.05)。结果表明人核糖核酸酶抑制因子干涉载体pLKO.1-ds RNH1构建成功。 相似文献
5.
将质粒pcDNA3．1-VEGF双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,并用酶切及测序等手段进行鉴定．而后利用脂质体转染包装细胞pA317,并检测病毒滴度．结果表明：成功构建了VEGF基因的重组逆转录病毒表达载体． 相似文献
6.
克隆、构建弹状胭脂鱼弹状病毒糖蛋白基因重组质粒,并进行表达和鉴定.用RT-PCR方法扩增出大小为1.5kb的CSRV-G基因片断,构建重组克隆质粒pRSET-C/CSRV-G,并将其转化进入大肠杆菌DH5α原核表达系统,酶切鉴定证明重组质粒的正确性.经IPTG诱导后表达重组蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行分析鉴定,诱导后能够表达预期的分子量为55 kD的融合蛋白. 相似文献
7.
目的：克隆人Lumican基因及构建Lumican基因真核表达载体并研究其对人子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖的影响。方法：取人新鲜正常子宫内膜组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增Lumican基因,将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建真核细胞表达载体pEGFP-N1-Lumican,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的Lumican基因通过脂质体介导下转染人子宫内膜癌细胞HEC-1A;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot 检测转染细胞HEC-1A的Lumican mRNA和蛋白表达。采用MTT法观察转染Lumican基因的人子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖能力。结果：重组质粒pEGFP-N1-Lumican经HindⅢ和BamHⅠ酶切,获得8311 bp片段和865 bp插入片段,序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致;荧光显微镜下可见转染的HEC-1A细胞有绿色荧光蛋白的表达;转染细胞HEC-1A的Lumican mRNA表达上调,Lumican蛋白相对上调率为74．62％（P＜0．05）。与对照组细胞比较,转染Lumican 基因的人子宫内膜癌细胞HEC-1A的抑制率为21．35％±2．78％。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Lumican,该载体在体外能有效抑制人子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖能力,为以Lumican基因为靶点研究其对人子宫内膜癌细胞HEC-1A的恶性生物学特性提供实验基础。 相似文献
8.
《赣南师范学院学报》2016,(3):58-60
WD重复蛋白(WD repeat protein)家族是一类含有多个保守WD基序的蛋白.该家族蛋白广泛存在于真核细胞中,参与细胞发育、增殖和凋亡等生理过程.WDR70隶属于WD重复蛋白家族,其生物学功能目前仍不清楚.本文以人cDNA为模板扩增WDR70基因;然后以pTag2b为载体,通过同源重组构建重组质粒并进行测序.同时将质粒转染至人肺癌细胞株A549中,进行WDR70蛋白的表达分析.结果显示该重组质粒在A549细胞中能有效表达.质粒pTag2B-WDR70的成功构建为进一步研究WDR70相关生物学功能提供实验基础. 相似文献
9.
基因工程中,需要将某种生物的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,通常是将目的基因用适当的工具酶连接到低等微生物如细菌的质粒、噬菌体等载体上,克隆得到重组DNA,由此构成该生物的基因文库。例如,带有人类所有基因克隆的大肠杆菌细胞构成了人类基因文库,可从这个文库中筛选、鉴定和研究人类的各种基因。 相似文献
10.
目的:探测细胞氧化低密度脂蛋白(LDL)过程中人α-防御素-1(HNP-1)基因的表达水平并构建人HNP-1的克隆载体。方法:提取人单核细胞系(THP-1)的总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法获得cDNA,采用pBS-T克隆HNP-1。结果:用RT-PCR在THP-1细胞总RNA中扩增出一条285 bp的DNA片段,与HNP-1 cD-NA片段大小一致。重组质粒经PCR和测序鉴定获HNP-1基因克隆。另外,LDL可诱导THP-1细胞HNP-1的mR-NA表达增加。结论:HNP-1可能参与LDL的细胞氧化过程,成功构建HNP-1克隆载体将为进一步亚克隆到原核及真核的表达载体提供了基础。 相似文献
11.
《实验技术与管理》2014,(1)
目的:构建microRNA的表达载体,再转染生物体细胞观察该microRNA的转录或表达情况,以获知它的作用机理及对生物体的影响。方法:以microRNA-21(简化为miR-21)为例说明构建表达载体的方法。根据microRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共约470个碱基序列,设计PCR引物,PCR扩增,PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒双酶切后,用T4连接酶进行连接反应,并转化入感受态细胞,筛选后对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析,并将其转染Hela细胞,经RT-PCR实验检测其表达情况。结果:pcDNA3.1(+)/miR-21过表达载体转染细胞后使得miR-21在细胞中过表达。结论:成功构建了miR-21的真核表达载体,为进一步研究miR-21功能及作用机制奠定实验基础。 相似文献
12.
目的:观察烟碱类似物ZY-1在细胞水平上对Aβ产生的影响及对转基因阿尔茨海默病小鼠学习记忆的作用.方法:在转染高表达烟碱受体亚型的SH-EP1-α4β2nAChR细胞株进行放射配基结合实验;Western blotting检测ZY-1对于转染了APP695质粒的SH-EP1-α4β2nAChR细胞产生Aβ的影响;在双转基因阿尔茨海默病小鼠B6C3-Tg(APPswe/PSEN1dE9)85Dbo/J品系通过Morris水迷宫试验和跳台试验观察ZY-1对小鼠学习记忆的影响.结果:①受体亚型结合分析,亲和力常数Ki= 21.5 nmol·L-1,亲和力很高,显示ZY-1有α4β2亚型结合特异性.②烟碱激动剂尼古丁和ZY-1可以显著降低细胞内Aβ水平.③Morris水迷宫试验和跳台试验表明,ZY-1中、高剂量对模型小鼠的空间学习记忆有显著改善作用.结论:ZY-1可能具备了作为AD治疗药物进一步开发的潜力,确切的成药性仍需进一步的试验来证明. 相似文献
13.
目的:构建唾液抗菌肽P113基因多拷贝串联重组体,并将其克隆到表达载体pET-28a.方法:根据大肠杆菌偏爱的密码子设计并合成人唾液抗菌肽P113基因,采用PCR技术构建P113基因的自融合多拷贝串联重组体polyP113,BAMH I和HindⅢ双酶切表达载体pET-28a和polyP113基因,将两者连接后转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选阳性菌落,PCR、酶切、测序鉴定重组质粒.结果:所构建的含有十拷贝P113基因的重组体正确克隆到表达载体pET-28a上,无突变.结论:成功构建含十拷贝唾液抗菌肽P113基因表达框的大肠杆菌表达载体. 相似文献
14.
从人直肠癌细胞株Colo320中提取总RNA,经RT-PCR扩增出SOD基因片段,经限制性内切酶（BamHI,Sinai）酶切后按正确的读码框顺序插入到pGEX-4T-2表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌,经菌落PCR和质粒双酶切鉴定、序列测定确认,证实成功地构建了人SOD基因融合表达载体．转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有与预期大小约44kD相吻合的融合蛋白带,获得了可溶性表达的目的蛋白,采用Glutathione Sepha—rose4B亲和层析对重组蛋白进行纯化,获得了纯度很高的目的蛋白． 相似文献
15.
设计小鼠Txt5基因的特异性引物,将小鼠c DNA作为模板,用PCR扩增出m Txt5编码区,并加入HA标签序列.将这一片段插入p MD-18T载体,再亚克隆至p Adtrack-cmv穿梭载体上.线性化后,转化BJ5183感受态细胞,在BJ5183中发生同源重组获得p Ad-Txt5质粒.p Ad-Txt5线性化后转染293A细胞,包装得到含Txt5基因的病毒.将病毒溶液感染大鼠原代心肌细胞,一段时间后观察绿色荧光,然后通过RT-PCR和免疫印迹法检测HA标签蛋白的表达.结果表明成功构建小鼠Txt5腺病毒表达载体并实现在大鼠原代心肌细胞中的表达. 相似文献
16.
为了制备用于在斑马鱼中热休克全身表达目的基因的转基因载体,通过分子克隆的方法从P{hsFLP}86E/TM6B转基因果蝇的基因组中克隆出FLP.并同时对HSP-Wnt5A-EGFP载体进行改造,Wnt5A由FLP代替,并在FLP和EGFP编码区之间插入带有多克隆位点的IRES序列,获得pTol2-HSP-FLP-IRES-EGFP转基因表达载体.利用得到的转基因载体显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎中进行表达分析,结果表明,经热激外源目的基因FLP和报告基因EGFP均能在斑马鱼中表达.pTol2-HSP-FLP-IRES-EGFP转基因表达载体的成功构建对于建立FLP/FRT重组系统的斑马鱼转基因实验模型具有重要意义. 相似文献
17.
通过两种从大肠杆菌中提取重组质粒pRSETDNA不同方法的比较,寻找提取重组质粒pRSET DNA的切实可行的方法.将含有目的质粒的菌株分别采用SDS碱裂解法和煮沸法进行质粒DNA小量提取,采用DU800核酸蛋白分析仪测定质粒DNA的产量及纯度.结果SDS碱裂解法获得质粒DNA产量为5.61 μg/ml菌液,A260/280=1.95;煮沸法获得质粒DNA产量为4.36μg/ml菌液,A260/280=1.78.与煮沸法相比,SDS碱裂解法获得质粒产量更多,纯度更高,更适合分子生物学常规实验的要求. 相似文献
18.
目的观察鞣花酸对前列腺癌PC-3细胞株的影响。方法：体外培养人前列腺癌PC-3细胞,加入0μg/ml、2．5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的鞣花酸作用于PC-3细胞,分别作用12小时、24小时和48小时后,应用MTr法测定各浓度组鞣花酸对PC-3细胞的生长抑制作用。应用流式细胞仪检测鞣花酸作用48小时后,PC-3细胞的周期时相变化及凋亡情况。应用免疫细胞化学检测10μg/ml鞣花酸作用24小时后,实验组与对照组细胞Caspase-3蛋白表达情况。结果：鞣花酸明显抑制PC-3细胞的生长,抑制效应呈时间依赖型和浓度依赖型,与对照组比较均有统计学意义（P〈0．05）。应用流式细胞仪检测结果显示,鞣花酸可将PC-3细胞阻滞于G1／S期,并诱导PC-3细胞凋亡。免疫细胞化学结果显示实验组Ctmpase-3蛋白表达明显升高。结论：鞣花酸对前列腺癌PC-3细胞株有明显的生长抑制和诱导凋亡作用。 相似文献
19.
通过钙转染法将含有人α肿瘤坏死因子CDNA的质粒PZ_(1p)/TNF转化大肠杆菌E·coliJM109,以Amp~r为标记筛选出阳性菌株.利用此阳性菌株体外培养获得人α肿瘤坏死因子CDNA的大量扩增,然后利用碱解法提取PZ_(1p)/TNF DNA,酶切后经低溶点琼脂糖法分离,回收人的肿瘤坏死因子CDNA. 相似文献
20.
《赣南师范学院学报》2020,(6):79-82
耐药性是导致肺癌患者化疗效果差的一个重要原因.本研究采用阿霉素浓度递增法建立人肺癌阿霉素耐药细胞株H1299 R,并采用多种实验验证其耐药特性.结果发现,H1299 R相对比于野生型细胞H1299 W形态和大小发生变化,但细胞增殖速度没有显著的差异;当使用浓度为5μg/mL阿霉素处理H1299 R和H1299 W细胞时,H1299 W细胞的增殖率明显低于H1299 R细胞;实时荧光定量PCR显示耐药性细胞株H1299 R中耐药相关基因的mRNA表达量明显高于H1299 W组.人肺癌H1299阿霉素耐药细胞株的成功建立,为进一步研究肺癌细胞产生耐药性的机制奠定了基础. 相似文献