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目的克隆小鼠内皮抑素（Endostatin）编码区cDNA序列及测序鉴定并构建pEgr-IFNγ-EndostatinA基因表达载体。方法从小鼠肝细胞提取总RNA，经逆转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增获得全长Endostatin基因，测序并利用基因重组技术构建pEgr-IFNγ-EndostatinYT．基因共表达质粒。结果分光光度计测定50倍稀释的总RNA抽提产物，A260=0．834，A280=0．407，A260：A280=2．049，总RNA浓度为1．668g／L。EndostatincDNA的RT-PCR产物与载体pMD18T连接并经测序证实Endostatin序列与文献报道完全一致，并构建了含Egr-1启动子的IFNγ和DEndostain双基因共表达质粒pEgY-IFNγ-Endostatin。结论成功克隆小鼠Endostatin基因，构建了pEgr-IFNγ-Endostatin双基因共表达质粒。 相似文献
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幽门螺杆菌CagA蛋白与CTB融合基因的克隆及其植物表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
目的 构建能在水稻胚乳中特异表达的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)和霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物表达载体.方法 采用高保真PCR技术分别从质粒pGEM CTB和幽门螺杆菌基因组DNA中扩增出CTB和cagA基因,然后用PCR方法直接融合CTB基因和cagA基因.又用PCR法改造了水稻Wx启动子,在其3′端融合加入Ω序列和Kozak序列.通过一系列亚克隆最终将两个融合基因和NOS终止子插入根癌农杆菌双元载体pCAMBI A1300的表达框架内.结果 PCR验证和测序分析证明,CTB和cagA融合基因以正确的方向插入到载体pCAMBI A1300中,并位于水稻Wx启动子后.结论 成功构建CTB和cagA融合基因的植物表达载体,为幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础. 相似文献
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利用高保真PCR酶从克隆载体pMD18T-GmPHD2中扩增出大豆PHD类转录因子GmPHD2,并于基因上下游分别引入XbaI和XhoI酶切位点;然后通过TA克隆、载体双酶切、连接、转化等技术手段,将其连入植物表达载体pBA002,构建了含GmPHD2和抗除草剂筛选标记Bar基因的植物表达载体pBA002-GmPHD2。重组质粒经PCR检测、双酶切及测序验证,表明GmPHD2基因已被完整、正确的插入到pBA002载体中,之后通过冻融法将重组质粒pBA002-GmPHD2成功导入农杆菌EHA105,利用此农杆菌不仅可以介导转化大豆,而且可以转化非同源的其他作物,为进一步开展植物抗逆性的基因工程研究提供了新基因资源。 相似文献
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赵珺 《内蒙古科技与经济》2008,(6)
从阿尔巴斯绒山羊及蒙古绵羊血中提取基因组DNA,根据已报道的BMP2基因的保守序列设计上下游引物,扩增山羊及蒙古绵羊的BMP2基因部分序列,将此片段克隆到pMD18-T载体中,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,并进行序列测定,并将两者序列进行比对.结果山羊该核苷酸片段与蒙古绵羊的同源性达99%,另与GenBank中人、小鼠、牛、绵羊的同源性分别为87%,85%,98%和99%.说明该基因在不同物种间具有较高的保守性,尤其是山羊与绵羊之间具有更高的保守性. 相似文献
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《科学中国人》2015,(26)
目的:构建Visfatin原核表达质粒,诱导表达并纯化重组人内脂素(Visfatin)。方法:从人LO2细胞中提取总RNA后,经RT-PCR法得到人Visfatin的c DNA序列,用以构建带HIS标签的Visfatin重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni柱亲和层析纯化融合蛋白。结果:PCR扩增出的目的基因片段为1600 bp左右,与理论大小一致。SDS-PAGE、Western blot、质谱分析数据证明了蛋白是Visfatin融合蛋白。结论:成功的表达并纯化得到带HIS标签的Visfatin融合蛋白。 相似文献
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一个新型湖羊瘤胃木聚糖酶基因的克隆和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
构建了一个湖羊瘤胃未培养微生物的Fosmid宏基因组文库,获得了12,000个克隆,文库外源DNA总容量为3.6×108 bp,筛选得到2个表达内切-1,4-β-木聚糖酶活性的克隆,并对其中的一个克隆UMXYL2进行亚克隆。结果表明存在一个完整的全长为1086 bp的ORF,编码一个可能的内切-1,4-β-木聚糖酶基因UMXYL2-1-1(accession No.FJ814702)。Blastp分析得知UMXYL2-1-1的编码产物与产琥珀酸丝状杆菌Fibrobacter succinogenes(accession No.AAA21848.1)的内切-1,4-β-木聚糖酶同源性最高,氨基酸序列相似性为67%,属于糖基水解酶家族11的成员。遗传进化分析表明UMXYL2-1-1基因可能是来自湖羊瘤胃微生物丝状杆菌属一个未培养的种。 相似文献
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近年来,随着D N A重组技术的深入发展,科学家们已能将重组D N A导入植物细胞,并成功培育了许多具有新的优良性状的转基因植物(transgenicplant)。主要包括耐除草剂、抗病虫害、抗逆(抗盐、碱等),此外还可以用转基因植物生产药物(如人的干扰素)、抗体、疫苗等。转基因植物的构建主要通过根癌土壤杆菌的Ti质粒。由于Ti质粒含有能整合到植物染色体中的T-D N A片段,使它能够成为植物基因工程的载体。T-D N A从根癌土壤杆菌转移到植物细胞核内是由T-DNA两侧25个碱基对的重复序列所介导,同时还需要Ti质粒毒性区(vir)某些基因产物(vir蛋白… 相似文献
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目的:设计获得5段hIL-18异构体,定向插入pEGFP-C1质粒形成融合基因,转染胰腺癌Bx-PC-3细胞并表达,为进一步研究改建的hIL-18蛋白功能奠定实验基础.方法:设计引物从pGEM-T-hIL-18质粒中PCR扩增得到5段不同的hIL-18片段,分别连接入pEGFP-C1载体构建不同的突变子(Mu0、Mu1、Mu2、Mu3和Mu4),转染原位胰腺癌BxPC-3细胞,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法检测转染细胞中hIL-18表达水平.结果:(1)五种重组质粒经酶切与测序证实构建成功;(2)BxPC-3细胞转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:(1)成功构建了hIL-18五种异构体的绿色荧光蛋白表达载体;(2)改建的hIL-18蛋白可与绿色荧光蛋白在BxPC-3细胞融合表达. 相似文献
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His-猪生长激素融合基因在大肠杆菌中的表达与纯化 总被引：1，自引：1，他引：1
将通过PCR技术改建并去除了信号肽的猪生长激素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a( ),构建出能利用Ni-NTAAgarose柱一步纯化表达产物的重组质粒pPGH020。探讨了大肠杆菌中重组猪生长激素的最佳表达条件和纯化方法,制备并纯化了兔抗pGH抗体。SDS鄄PAGE和Westernblot的分析结果表明,26.5kD处有包括His·Taq、thrombin位点序列和pGH序列的融合蛋白特异条带。凝胶扫描估测猪生长激素的表达量占大肠杆菌胞浆蛋白的17.3%左右。 相似文献
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一株嗜热梭菌β-葡聚糖酶基因的克隆和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
提取嗜热梭菌(Clostridium.sp)基因组DNA,首次通过PCR克隆了该菌的β-葡聚糖酶基因全长,结果表明:该基因全长1040bp,ORF为1003bp,编码334个氨基酸,计算分子量为37.8kD,等电点为7.67。经Blast分析,该序列与热纤梭菌同源性最高(99%),而与基因库中嗜热梭菌的同源性为94%,该基因已被GenBank接受(AY225318)。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段和表达载体pET鄄30a( )后相连接,构建重组表达载体pET鄄clo,并导入BL21细菌中表达.酶学特性表明:SDS鄄PAGE电泳在37kD左右有表达蛋白带,该工程菌最适酶活29.4U/mL,是出发菌的15倍,最适温度在80℃左右,最适pH在9左右。该工程菌可构建耐热性好、酶活高的杂合基因工程菌。 相似文献
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Cd极易被水稻等作物吸收并伴随食物链在人体内累积,严重威胁人类健康.基于水稻Cd累积机制的现有研究,克隆与水稻Cd累积相关的基因Os LCD和Os HMA3,并克隆一个维管组织特异性表达的启动子Os MTP11P,利用Gateway技术及传统酶切、连接方法,成功构建适用于水稻等单子叶植物农杆菌转化的RNA干扰载体pRI-M-LCD和根特异性表达载体p CB2022-H.期望通过这2个载体共转化水稻,使大量的Cd扣留在根细胞的液泡中,限制Cd向地上部分及籽粒中的转运,从而实现Cd在水稻籽粒中的低累积. 相似文献
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酯酶被应用在很多方面,但是能够满足工业需要的天然酯酶却很少。利用PCR技术从Zunongwangia profunda克隆出了酯酶基因estA。基因estA含有一段1272 bp的ORF,序列分析发现与Anaerophaga thermohalophila的酯酶家族基因同源性为60%。利用表达菌株E.coli BL21(DE3),pGEX-6p-1质粒构建表达载体,并对其进行蛋白表达并纯化回收得到EstA,以便后续酶学性质及应用价值探究。 相似文献
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杭琦 《内蒙古科技与经济》2001,(2):99-99
DNA或 RNA瘤病毒能将其遗传物质转入宿主细胞而引起细胞转化 ,这种能力使有关研究者们想到以它们作为基因治疗的基因载体。虽然确定其安全性难度很大 ,但重组病毒法在实验室里行之有效。转基因效能较高 ,只要解决了其安全性问题 ,将在基因治疗中起到重要作用。本文概述了几种主要病毒载体及其特点。1 逆转录病毒载体逆转录病毒包括一大类基因组 ,长约 1 0 Kb的单链 RNA的有被病毒 ,病毒生活史中 ,其 RNA逆转录成双链 DNA整合到宿主细胞基因组内长期表达。病毒基因组有 gag,pol,env三个结构基因和长末端重复序列 ( LTR) ,包装信号 (… 相似文献
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在成功建立稳定分泌鼠抗人B7-2杂交瘤细胞株基础上,扩增并克隆出该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人B7-2单链抗体(B7-2 ScFv)基因。为便于表达产物的纯化,在抗人B7-2 ScFv的C端增加了6×His tag序列。将其克隆至表达载体pET32a并在大肠杆菌中进行原核表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,抗人B7-2 ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)菌中获得表达,重组融合蛋白的相对分子量约为43 kD,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经溶解包涵体,体外复性和Ni-NTA亲和柱纯化,获得了高纯度的抗人B7-2 ScFv,纯化蛋白得率约16.2%。成果为抗人B7-2单链抗体的生物学活性研究和抗肿瘤药物开发奠定了基础。 相似文献
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当把普通牛(Bos taurus)中的一个基因(NCBI索引号:XM_865429)导入质粒pGAPZ alphaA后并把该质粒通过电击等方法导入pichiapastorisX33酵母菌株后发现得不到表达产物,本文通过生物信息学方法从密码子偏爱性角度分析了表达不好的原因并在基因中对不匹配的密码子进行定位和提出突变建议. 相似文献
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《科技通报》2016,(1)
在1株污染半夏组培苗的枝状枝孢真菌(Cladosporium cladosporioides DF15)中检测到5条双链RNA(double-strand RNA,ds RNA)条带。通过M-SPAT(modified single-primer amplification technique)、克隆测序获得5条ds RNA的序列信息,分别为ds RNA1(2434bp)、ds RNA2(2241bp)、ds RNA3(2008bp)、ds RNA4(1261bp)和ds RNA5(942bp)。经Blast比对,ds RNA1编码蛋白的氨基酸序列与侵染荚孢壳科、球腔菌科真菌的双分病毒属(Partitivirus)病毒,以及侵染辣椒等植物的双分病毒科(Partitiviridae)病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp)序列相似度最高。氨基酸序列系统进化树分析表明,ds RNA1与侵染真菌的双分病毒属病毒亲源关系更近。通过核苷酸序列5'非编码区(untranslated regions,UTR)的比对发现,5条ds RNA的5'UTR序列相似度高达50.0%~95.3%,并含有2段保守序列5'-GUAAAUAAACCUU-3'和5'-C(/G)TA(/AG)CAAGT(/C)AT-3'。根据上述分析,推测5条ds RNA序列来自同1种病毒基因组,并且为侵染C.cladosporioides的1种新双分病毒科双分病毒属病毒,命名该病毒为C.cladosporioides virus 1。 相似文献