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《科学中国人》2015,(26)
目的构建SLO原核表达质粒,重组蛋白的诱导表达并纯化。方法提取链霉菌溶血素O模板DNA,PCR法扩增slo基因。构建融合表达重组质粒p GEX-6p-1-slo和pet32a-tev-slo,将正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21-DE3,使用异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白。采用亲和层析纯化重组蛋白,切除标签后,再通过亲和层析纯化,获取SLO重组蛋白。结果 PCR扩增出slo基因,基因片段(1700 bp)与理论一致。经SDSPAGE,蛋白质印迹显示重组蛋白相对分子质量为55 k Da,与数据库中的相对分子质量结果相符。结论成功构建了slo原核表达质粒,表达并纯化了SLO重组蛋白。 相似文献
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采用ＰＳＭＴＥ７作为质粒,进行ＨＩＶ－１ｅｎｖ基因对ＣＤ４阳性单核细胞Ｕ９３７－２的导入与表达,ｅｎｖ基因导入细胞在微量重金属镉的诱导下,激活妄动子表达ｇｐ１２０及ｇｐ１６０经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ转移显色后,可得清晰的ｅｎｖ目的的条带,此外,充式细胞仪对表达的ｇｐ１２０与ＣＤ４位点的结合作了分析,验证了该表达蛋白的结构与活性,从实验系可以观察到的表达ｇｐ１６０的ＣＤ４细胞株由于表达ｇｐ１６０而引 相似文献
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幽门螺杆菌CagA蛋白与CTB融合基因的克隆及其植物表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
目的 构建能在水稻胚乳中特异表达的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)和霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物表达载体.方法 采用高保真PCR技术分别从质粒pGEM CTB和幽门螺杆菌基因组DNA中扩增出CTB和cagA基因,然后用PCR方法直接融合CTB基因和cagA基因.又用PCR法改造了水稻Wx启动子,在其3′端融合加入Ω序列和Kozak序列.通过一系列亚克隆最终将两个融合基因和NOS终止子插入根癌农杆菌双元载体pCAMBI A1300的表达框架内.结果 PCR验证和测序分析证明,CTB和cagA融合基因以正确的方向插入到载体pCAMBI A1300中,并位于水稻Wx启动子后.结论 成功构建CTB和cagA融合基因的植物表达载体,为幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础. 相似文献
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正通过基因工程技术把外源性目标基因导入某种受体动物的生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎,并在其染色体上稳定整合,之后经过各种发育途径把外源性基因传递到子代,这就是动物的转基因,或称转基因动物。外源性基因导入受体动物有不同的方法,同时,由于有不同的受体动物,因此要根据实际情况采用不同的方法对动物进行转基因。大致而言,动物转基因的方法有:逆转录病毒法、显微注射法、胚胎干细胞介导法、精子载体法和体细胞核移植法(体细胞克隆介导法)等。通过逆转录病毒转移基因研究人员早就发现,逆转录病毒常常能侵入宿主细胞并整合于细胞中的DNA,因此逆转 相似文献
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《科学中国人》2015,(26)
目的:构建Visfatin原核表达质粒,诱导表达并纯化重组人内脂素(Visfatin)。方法:从人LO2细胞中提取总RNA后,经RT-PCR法得到人Visfatin的c DNA序列,用以构建带HIS标签的Visfatin重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni柱亲和层析纯化融合蛋白。结果:PCR扩增出的目的基因片段为1600 bp左右,与理论大小一致。SDS-PAGE、Western blot、质谱分析数据证明了蛋白是Visfatin融合蛋白。结论:成功的表达并纯化得到带HIS标签的Visfatin融合蛋白。 相似文献
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目的:设计获得5段hIL-18异构体,定向插入pEGFP-C1质粒形成融合基因,转染胰腺癌Bx-PC-3细胞并表达,为进一步研究改建的hIL-18蛋白功能奠定实验基础.方法:设计引物从pGEM-T-hIL-18质粒中PCR扩增得到5段不同的hIL-18片段,分别连接入pEGFP-C1载体构建不同的突变子(Mu0、Mu1、Mu2、Mu3和Mu4),转染原位胰腺癌BxPC-3细胞,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法检测转染细胞中hIL-18表达水平.结果:(1)五种重组质粒经酶切与测序证实构建成功;(2)BxPC-3细胞转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:(1)成功构建了hIL-18五种异构体的绿色荧光蛋白表达载体;(2)改建的hIL-18蛋白可与绿色荧光蛋白在BxPC-3细胞融合表达. 相似文献
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近年来,随着D N A重组技术的深入发展,科学家们已能将重组D N A导入植物细胞,并成功培育了许多具有新的优良性状的转基因植物(transgenicplant)。主要包括耐除草剂、抗病虫害、抗逆(抗盐、碱等),此外还可以用转基因植物生产药物(如人的干扰素)、抗体、疫苗等。转基因植物的构建主要通过根癌土壤杆菌的Ti质粒。由于Ti质粒含有能整合到植物染色体中的T-D N A片段,使它能够成为植物基因工程的载体。T-D N A从根癌土壤杆菌转移到植物细胞核内是由T-DNA两侧25个碱基对的重复序列所介导,同时还需要Ti质粒毒性区(vir)某些基因产物(vir蛋白… 相似文献
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利用高保真PCR酶从克隆载体pMD18T-GmPHD2中扩增出大豆PHD类转录因子GmPHD2,并于基因上下游分别引入XbaI和XhoI酶切位点;然后通过TA克隆、载体双酶切、连接、转化等技术手段,将其连入植物表达载体pBA002,构建了含GmPHD2和抗除草剂筛选标记Bar基因的植物表达载体pBA002-GmPHD2。重组质粒经PCR检测、双酶切及测序验证,表明GmPHD2基因已被完整、正确的插入到pBA002载体中,之后通过冻融法将重组质粒pBA002-GmPHD2成功导入农杆菌EHA105,利用此农杆菌不仅可以介导转化大豆,而且可以转化非同源的其他作物,为进一步开展植物抗逆性的基因工程研究提供了新基因资源。 相似文献
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目的:构建真核表达IL-18-GPI融合基因的表达载体,观察融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达动力学及生物学活性,为进一步研究细胞因子作为免疫增强剂在临床肿瘤治疗中的应用奠定基础.方法:通过RT-PCR的方法从脂多糖刺激的外周血淋巴细胞中钓取IL-18基因,通过共用限制性酶切位点与GPI相连形成pcDNA-IL-18-GPI真核表达质粒.将质粒转染CHO细胞后建立稳定表达融合蛋白的细胞株用于融合蛋白的提取.对提取纯化的蛋白进行生物学特性、蛋白质转移分析和γ-IFN诱导实验.结果:获得714 bp的核酸序列并构建重组质粒pcDNA-IL-18-GPI.SDS-PAGE和West-blot显示在CHO细胞中表达的IL-18-GPI融合蛋白分子量约为27.5 kD,该蛋白具有明显的蛋白转移和诱生γ-IFN的作用.结论:IL-18-GPI融合蛋白是一种潜在的肿瘤疫苗增强剂,具有良好的应用前景. 相似文献
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目的克隆小鼠内皮抑素(Endostatin)编码区cDNA序列及测序鉴定并构建pEgr-IFN(Y)-Endostatin双基因表达载体.方法从小鼠肝细胞提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增获得全长Endostatin基因,测序并利用基因重组技术构建pEgr-IFN(Y)-Endostatin双基因共表达质粒.结果分光光度计测定50倍稀释的总RNA抽提产物,A260=0.834,A280=0.407,A260A280=2.049,总RNA浓度为1.668g/L.EndostatincDNA的RT-PCR产物与载体pMD18T连接并经测序证实Endostatin序列与文献报道完全一致,并构建了含Egr-1启动子的IFNY和Endostain双基因共表达质粒pEgY-IFN(Y)-Endostatin.结论成功克隆小鼠Endostatin基因,构建了pEgr-IFN(Y)-Endostatin双基因共表达质粒. 相似文献