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为了在小鼠模型中更深入地研究nulp1蛋白在心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增出小鼠nulp1基因的部分编码区并连接入pET-28a表达载体中,之后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)通过IPTG诱导表达Hisnulp1融合蛋白,对该融合蛋白采用Ni-IDA凝胶柱层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体,并用western blotting对抗体进行分析.结果表明,获得了高效价的特异性兔抗nulp1多克隆抗体.这为nulp1功能的进一步研究奠定了基础. 相似文献
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利用RT—PCR技术从HEK293细胞中克隆到人Rab7基因,通过双酶切将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coliDH5α感受态细胞,获得阳性克隆．24℃下IPTG诱导表达,Glutathi—one Sepharose 4B纯化后获得高纯度的Rab7蛋白．并以此为抗原免疫小白鼠,获得了Rab7的特异性抗体． 相似文献
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目的:原核表达并纯化大型溞胆碱酯酶(ChE),制备鼠抗大型溞ChE多克隆抗体,并对抗体的适用性进行研究。创新点:首次通过原核表达获得了大型溞重组ChE蛋白,通过免疫小鼠获得了高效价、高特异性的多克隆抗体,通过样品检测证明了抗体的适用性。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)技术获得大型溞ChE基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体p ET-29a(+),构建重组表达质粒p ET-ChE,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达;对表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酶活性检测,并对蛋白进行纯化(图4);使用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体(图5),用酶联免疫吸附分析法(ELISA)对处于三唑磷和低温胁迫下以及经反复冻融处理的大型溞体内的ChE含量变化进行检测(图7、表6和7),以评价抗体的可适用性。结论:获得了高纯度的ChE重组蛋白;免疫小鼠后,获得了特异性强、高效价的抗体;通过对处于三唑磷和低温胁迫下以及经过反复冻融处理的大型溞体内的ChE含量的检测,证明了抗体的适用性。 相似文献
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克隆、构建弹状胭脂鱼弹状病毒糖蛋白基因重组质粒,并进行表达和鉴定.用RT-PCR方法扩增出大小为1.5kb的CSRV-G基因片断,构建重组克隆质粒pRSET-C/CSRV-G,并将其转化进入大肠杆菌DH5α原核表达系统,酶切鉴定证明重组质粒的正确性.经IPTG诱导后表达重组蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行分析鉴定,诱导后能够表达预期的分子量为55 kD的融合蛋白. 相似文献
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Li-rong SHEN Yi-ran WANG Liang ZHAI Wen-xiu ZHOU Liang-liang TAN Mei-lu LI Dan-dan LIU Fa XIAO 《Journal of Zhejiang University. Science. B》2015,16(2):155-166
目的:为蜂王浆主蛋白1(MRJP1)的快速检测和鉴别提供科学依据,为蜂王浆的质量控制提供技术支持。创新点:首次比较了MRJP1特异性多克隆抗体与MRJP1重组表达蛋白多克隆抗体对王浆主蛋白家族的免疫反应差异,验证了蜂王浆中MRJP1蛋白降解与保温时间的相关性,建立了以MRJP1作为蜂王浆新鲜度生物标志物的快速检测方法。方法:通过蜂王浆主蛋白家族蛋白的氨基酸序列同源性分析,筛选出MRJP1的特异性多肽区域,进行人工合成,免疫兔子后取血清制备成特异性多克隆抗体。用蛋白质印迹法(Western blot)检测了MRJP1特异性多克隆抗体与MRJP1重组表达蛋白多克隆抗体对王浆主蛋白家族的免疫反应。以新鲜蜂王浆为对照品,用MRJP1特异性抗体酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)法和变性电泳胶灰度扫描法分别测定保温(40°C)7~49天的蜂王浆中MRJP1含量的变化,并进行了相关性分析。结论:MRJP1的特异性抗体对MRJP1蛋白具有专一的免疫识别特性,可特异性地检测代表蜂王浆新鲜度的MRJP1含量变化,并鉴别蜂王浆的真伪。 相似文献
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为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR) 从弓形虫RH 株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性. 相似文献
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为构建弓形虫主要表面抗原1(SAG1)的原核重组表达质粒并获得重组表达蛋白,采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株基因组DNA中扩增SAG1基因,经克隆和测序后,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,PCR和双酶切鉴定阳性菌株,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定观察其诱导的抗体应答.结果表明,PCR扩增出SAG1基因的特异片段,获得的阳性克隆序列与GenBank中的SAG1基因序列一致,SAG1基因被亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,在BL21中表达了SAG1,表达的蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.以上结果说明,已成功构建了弓形虫SAG1的重组表达质粒,在大肠杆菌中表达的SAG1具有良好的免疫学活性. 相似文献
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目的获得重组TsARG2基因蛋白,为进一步研究其功能和制备特异抗体奠定基础.方法根据已报道的TsARG2基因序列,采用RT-PCR的方法获得TsARG2基因.将所得的PCR产物插入原核表达载体pQE30中,得重组质粒(pQE/TSARG2)并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱导表达出带有六个组氨酸的融合蛋白,采用镍固定金属亲和层析法纯化.结果序列分析表明TSARG2基因成熟肽编码区含有918bp,编码305个氨基酸;与GenBank(AY040204)中已报道的TSARG2分离物的核苷酸序列有100%同源性.经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的66%,分子质量约为35kDa.经Ni2 -NTAagarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带.结论在大肠杆菌中获得了TsARG2基因蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础. 相似文献
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孙晓东 《陕西教育学院学报》2010,26(2):106-107,121
为了构建人C6orf210基因原核表达载体,并在E．coliBL21中表达并纯化。采用RT—PCR扩增人C6orf210基因片段,并将其克隆到原核表达载体Pet21a中,构建重组质粒pET21a—C6ort210。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E．coliBL21,经IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示获得全长为1188bp的人的CAiorf210基因片段。以构建的重组质粒pET21a—C6orf210转化E．coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约66000的融合蛋白。经SINS—PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为C6orf210。 相似文献
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以凡纳滨对虾为研究对象,通过RT-PCR技术扩增出铁蛋白（Ferritin）基因,经特定的酶切（Notl,Smal）后插入到表达质粒pGEX-4T-2上构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌．经菌落PCR和质粒双酶切鉴定确认,证实成功地构建了对虾铁蛋白基因的原核表达载体．再对重组菌用IPTG诱导表达,采用Glutathione Sepharose4B亲和层析得到目的蛋白用于制备抗体,为研究铁蛋白在对虾抗病毒免疫中的作用奠定基础． 相似文献
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绿僵菌是一类广泛应用于生物防治的昆虫病原真菌.研究表明小RNA能够调控基因的表达,其中Argonaute基因在整个小RNA通路中发挥重要的作用.本研究通过RT-PCR的方法从绿僵菌中获得了Argonaute基因的部分功能片段,构建了其重组原核表达载体,将重组载体转化至大肠杆菌进行诱导表达;采用镍柱亲和纯化重组的目的蛋白并通过Western blot技术鉴定.结果发现：通过RT-PCR的方法获得长度约为950bp的基因片段;重组原核表达载体经诱导表达后,SDS-PAGE检测发现分子量约为34kDa的目的蛋白条带;诱导5h后蛋白的表达量最高,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,经Western blot技术检测,重组蛋白可与His-tag抗体发生特异性反应.该纯化重组蛋白的获得为将来绿僵菌Argonaute蛋白抗体的制备,并进一步通过该抗体获得绿僵菌体内的小RNA及其靶基因提供了基础. 相似文献
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Ying-ying LU Xian YANG Wen-qing CHEN Zhen-yu JU Zhang-fei SHOU Juan JIN Xiao-hui ZHANG Jiang-hua CHEN Hong JIANG 《Journal of Zhejiang University. Science. B》2014,(6)
研究目的:分析在中国人群中,端粒缩短以及相关衰老因子与人类IgA肾病发生进展的关系。创新要点:目前的研究发现,端粒功能缺陷是限制分裂增殖、细胞衰老的重要分子机制。它不仅仅与衰老相关,而且在疾病的发生、进展过程中都有直接影响。肾脏的正常衰老过程伴随端粒逐渐缩短,端粒功能缺陷可以加速慢性肾脏疾病进程,并伴随相关衰老因子cathelin相关抗菌肽(CRAMP)、延长因子-1α(EF-1α)、几丁质酶(chitinase)和微管不稳定蛋白(stathmin)等表达增加。本项研究首次在中国人群中,揭示端粒缩短以及相关衰老因子与人类IgA肾病发生进展的关系。研究方法:采用双盲法,以IgA肾病患者(n=177)为实验组,以狼疮肾炎(n=50)、糖尿病肾病(n=30)和局灶节段性肾小球硬化(n=30)病人以及健康人(n=83)为对照组,通过定量荧光原位杂交(qFISH)检测了肾脏组织的端粒长度,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了血液、尿液中的CRAMP、EF-1α、stathmin的含量,运用几丁质酶试剂盒(CS1030)检测了血液、尿液中几丁质酶的酶活性,运用免疫荧光染色检测了组织中CRAMP的表达情况。重要结论:端粒缩短和相关炎症蛋白与IgA肾病的发生发展有关,并为IgA肾病的特异性诊断和及预后评估提供可靠的研究基础。 相似文献
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GAL4蛋白是酵母中的一类转录因子,它能够与特定的上游激活序列结合,并驱动UAS下游基因的表达。将酵母中的GAL4和UAS元件分别引入到果蝇中,含有UAS-目的基因的转基因果蝇品系,无法在亲本中表达,只有与驱动者GAL4品系杂交后的子一代中,目的基因才会表达。在本科遗传学实验中,引入eyelessGAL4和UAS-Ras转基因果蝇品系杂交实验,通过观察F1代复眼中原癌基因ras表达后的表型,使学生了解如何通过GAL4-UAS系统在模式动物黑腹果蝇中实现靶基因的时空表达,认识GAL4-UAS系统在研究果蝇遗传发育中的重要性和优越性,理解分子调控、靶基因表达与个体的遗传和发育每个环节都是可以操作和控制的现代遗传学实验理念。 相似文献
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通过PCR扩增高致病性禽流感H5N1的HA和HA1基因片段,利用原核表达系统表达重组HA和HA1蛋白,并用SDS-PAGE,Western-blotting和血凝试验进行重组HA蛋白的鉴定和血凝活性鉴定.结果表明,经过HA蛋白胞外段分析、重组载体的酶切鉴定得出的重组HA蛋白,在血凝试验中能与HA特异性抗体结合,并有较高的血凝活性.利用表达载体pET42a表达AIV-H5亚型的HA基因,为进一步利用重组蛋白研制AIV-H5抗体的ELISA检测方法,研制抗AIV-H5亚型的单克隆抗体提供基础. 相似文献
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从假单胞菌（Pseudomonassp．）XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌（Escherichiacoli）中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础．以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框（0RF）克隆至融合表达载体pET30a（＋）进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析．实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E．coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20％;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92％以上．表达蛋白具有良好活性． 相似文献
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肌肉生长抑制素（MSTN）属于转化生长因子超家族,是主要在骨骼肌中特异性表达且功能比较专一的肌肉发育负调控因子．鱼类的MSTN基因比较复杂,具有不同的同源基因．本文综述了鱼类MSTN基因的结构、种类、时空表达特征,MSTN的作用机理及生物学功能,鱼类MSTN基因多态性研究以及MSTN基因在鱼类生产中潜在的应用前景． 相似文献
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耐辐射异常球菌(D.radiodurans R1)osmC基因(DR_1538)编码的渗透诱导胁迫蛋白是一种在氧化胁迫中起重要作用的过氧化物酶.用PCR方法从耐辐射异常球菌中扩增出osmC基因的全长序列(441bp),采用原核表达系统对其进行表达纯化,获得了分子量大小约为18.7 kDa的带有His标签的融合蛋白.利用在线网站对OsmC蛋白的生物信息学分析,结果表明:OsmC蛋白由146个氨基酸组成,理论等电点为5.81,为亲水性蛋白;二级结构主要是由α-螺旋及不规则卷曲组成.OsmC蛋白的纯化及生物信息学分析为后续深入研究其功能奠定了基础. 相似文献
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苦瓜作为药食同源的植物,含有许多活性成分,其中核糖体失活蛋白MAP30是近年来研究较多的一种.根据G enbank中MAP30序列,采用PCR技术,从苦瓜基因组DNA中扩增出该基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-28a上,构建重组质粒pET-MAP30,经克隆载体转化菌液PCR鉴定,结果显示成功构建MAP30的原核表达载体. 相似文献