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拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii〗)NRRL-B593在葡萄糖基质中可以代谢产生丁醇、乙醇、异丙醇。乙醇脱氢酶(ADH)是产生醇类的关键酶,比较了拜氏梭菌(C.beijerinckii)NRRL-B593在葡萄糖基质与氨基酸基质中ADH活性,为进一步研究该菌株的代谢及表达调控提供理论基础。首先通过监测C.beijerinckii NRRL-B593在不同培养基中D_(600)值,绘制生长曲线,后在8000 r/min,10min下收集对数期与稳定期的细胞,利用厌氧型细胞破碎仪French Press获得无细胞抽提物(CFE),最后通过Bradford法测量蛋白质含量,在厌氧条件下利用丙酮为底物,NADPH依赖型的氧化反应测其酶活力。结果显示,稳定期的ADH酶活力远远高于对数期酶活力高,氨基酸培养基中的ADH酶活力高于葡萄糖培养基。 相似文献
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本实验首先在MS基本培养基上培养盐地碱蓬(SuaedaSalsa(L.)Pall.)的无菌苗,然后用上述无菌苗茎段为外植体在MS1培养基上诱导培养,初始愈伤组织为深黄色、非松脆型,愈伤组织诱导频率为95.64%以上.在继代培养基MS2上继代数月后得到了生长旺盛、疏松、呈乳白色的愈伤组织,用不同组成浓度的酶解液酶解松散型愈伤组织,进一步分离、提纯制备出具有活力的原生质体.以愈伤组织为材料制备原生质体的最适酶解液浓度为10g/L纤维素酶 5g/L离析酶 0.6mol/L甘露醇 0.05mol/L CaCl2.2H2O 0.1%MES.最适酶解时间为12-16h. 相似文献
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本试验用VP1基因C末端与表达载体连接,转化到大肠杆菌中,经IPTG诱导表达,收集不同时间段的菌液进行SDS-PAGE,结果表明重组的VP1基因C末端蛋白在大肠杆菌中能高效表达,表达的目的蛋白分子量约为16kd,而且重组菌诱导裂解物可在16kd处看到一条特异的蛋白条带,与预期大小一致,阴性对照未出现表达条带,而且重组菌在IPTG终浓度为1mmoL/L诱导6 h时表达量最大。表达产物主要以包涵体的形式存在,提取和裂解包涵体后,进一步纯化表达的目的蛋白,可获得纯度达70%以上的目的蛋白。 相似文献
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厌氧真菌能够产生高比活力的纤维素酶,但由于对厌氧环境的生产条件要求严格,生长速度缓慢,并不适合规模生产。本研究将厌氧真菌内切型-β-葡聚糖酶基因af1与大肠杆菌表达载体pET-28a(+)连接,得到重组质粒pET-28a(+)-af1。以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,重组质粒转化后获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-af1。采用SDS-PAGE蛋白电泳对重组大肠杆菌的表达产物进行分析,在40 kDa附近得到与目的基因af1表达蛋白理论值相当的明显条带。AF1酶蛋白的最适pH为6.0,最适温度为45°C。重组大肠杆菌的摇瓶产酶试验结果显示:诱导培养18 h时,内切型-β-葡聚糖酶(CMC酶)活力可达410 U/mL。该项研究工作为进一步构建内切型-β-葡聚糖酶高产菌株奠定了良好的基础。 相似文献
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目的研究氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL, ox-LDL)是否能在基因和蛋白两个水平诱导内皮细胞表达凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(lectin-like oxidized LDL receptor, LOX-1),以探讨LOX-1在动脉粥样硬化形成和发展中的作用.方法将不同浓度ox-LDL(20,40,60,80 mg/L)与内皮细胞共孵育24 h及浓度40 mg/L的ox-LDL作用内皮细胞不同时间(0、3、6、12、24 h),反转录聚合酶链反应检测LOX-1 mRNA水平表达,细胞酶联免疫法测定LOX-1蛋白水平表达.结果加入Ox-LDL 20 mg/L使LOX-1 mRNA和蛋白表达量增加(P＜0.01),40 mg/L使其表达量达最高峰,随后逐渐下降.而同一浓度下从0 h～24 h的趋势是LOX-1 mRNA和蛋白逐渐增加(P＜0.01),在12 h增加最明显.结论氧化型低密度脂蛋白呈剂量依赖性和时间依赖性地上调LOX-1 mRNA和蛋白表达,LOX-1可能在动脉粥样硬化形成和发展中起重要作用. 相似文献
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以马铃薯淀粉为原料,通过单因素实验方法研究湿法工艺、喷雾工艺制备酶解马铃薯辛烯基琥珀酸淀粉酯,并对性能进行研究。确定制备参数:淀粉乳浓度40%、p H值8.9、温度35℃、时间4h、酸酐3%。酶添加量为0.2(U/ml),在此条件下,乳液乳化能力达到保油4.5倍,乳液稳定性48h,0.1,干粉溶解不托尾,溶解时间30min以内,干粉流动性测定值2.5。 相似文献
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《科学中国人》2015,(26)
目的构建SLO原核表达质粒,重组蛋白的诱导表达并纯化。方法提取链霉菌溶血素O模板DNA,PCR法扩增slo基因。构建融合表达重组质粒p GEX-6p-1-slo和pet32a-tev-slo,将正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21-DE3,使用异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白。采用亲和层析纯化重组蛋白,切除标签后,再通过亲和层析纯化,获取SLO重组蛋白。结果 PCR扩增出slo基因,基因片段(1700 bp)与理论一致。经SDSPAGE,蛋白质印迹显示重组蛋白相对分子质量为55 k Da,与数据库中的相对分子质量结果相符。结论成功构建了slo原核表达质粒,表达并纯化了SLO重组蛋白。 相似文献
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《科学中国人》2015,(26)
目的:构建Visfatin原核表达质粒,诱导表达并纯化重组人内脂素(Visfatin)。方法:从人LO2细胞中提取总RNA后,经RT-PCR法得到人Visfatin的c DNA序列,用以构建带HIS标签的Visfatin重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni柱亲和层析纯化融合蛋白。结果:PCR扩增出的目的基因片段为1600 bp左右,与理论大小一致。SDS-PAGE、Western blot、质谱分析数据证明了蛋白是Visfatin融合蛋白。结论:成功的表达并纯化得到带HIS标签的Visfatin融合蛋白。 相似文献
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目的:探讨氯沙坦对百草枯诱导HK-2细胞损伤的影响及机制。方法:常规培养HK-2细胞,分为空白对照组:未采用任何药物干预培养24h;模型组:以800μmol/L百草枯培养24h;氯沙坦预治疗组:先以75μmol/L氯沙坦培养1h,再以75μmol/L氯沙坦+800μmol/L百草枯培养24h。观察各组细胞TLR-4、NF-?B、TNF-α、IL-6的表达。结果:与空白对照组相比,模型组TLR-4、NF-?B、TNF-α、IL-6表达升高(P0.05);与模型组相比,氯沙坦预治疗组TLR-4、NF-?B、TNF-α、IL-6表达水平显著降低(P0.05)。结论:氯沙坦预处理能够抵抗百草枯诱导的HK-2细胞损伤,其机制可能与抑制TLR-4/NF-?B信号通路活化,减少炎症因子的表达有关。 相似文献
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mRNA在细胞质内的稳定性是调控基因表达的重要方式。细胞以mRNA降解的方式对过时的、突变有害的mRNA进行及时清除以保证基因的正确表达和细胞正常的生命活动。其中脱帽酶Dcp1/Dcp2在mRNA降解中起到主要作用，但对其降解mRNA的详细作用机制了解甚少。到目前为止，尚没有该基因市售的抗体出现，阻碍了对该基因机理的研究。本文目的是利用PCR方法，从人的胎肝文库中克隆到Dcp2基因，制备其多克隆抗体血清。实验结果显示，通过溴化氰偶联柱子对该多克隆抗体血清经纯化得到的多克隆抗体，用于Western Blotting 试验，可以检测到该蛋白内源性的表达；用于激光共聚焦定位实验显示该内源性蛋白定位在细胞核内；此抗体同时可用于免疫沉淀实验。因此Dcp2基因和多克隆抗体的获得，为进一步研究该基因的功能创造了条件。 相似文献
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His-猪生长激素融合基因在大肠杆菌中的表达与纯化 总被引：1，自引：1，他引：1
将通过PCR技术改建并去除了信号肽的猪生长激素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a( ),构建出能利用Ni-NTAAgarose柱一步纯化表达产物的重组质粒pPGH020。探讨了大肠杆菌中重组猪生长激素的最佳表达条件和纯化方法,制备并纯化了兔抗pGH抗体。SDS鄄PAGE和Westernblot的分析结果表明,26.5kD处有包括His·Taq、thrombin位点序列和pGH序列的融合蛋白特异条带。凝胶扫描估测猪生长激素的表达量占大肠杆菌胞浆蛋白的17.3%左右。 相似文献
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酯酶被应用在很多方面,但是能够满足工业需要的天然酯酶却很少。利用PCR技术从Zunongwangia profunda克隆出了酯酶基因estA。基因estA含有一段1272 bp的ORF,序列分析发现与Anaerophaga thermohalophila的酯酶家族基因同源性为60%。利用表达菌株E.coli BL21(DE3),pGEX-6p-1质粒构建表达载体,并对其进行蛋白表达并纯化回收得到EstA,以便后续酶学性质及应用价值探究。 相似文献
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大豆蛋白酶解工艺条件的研究 总被引：5，自引：0，他引：5
采用 As 3.350酸性蛋白酶对豆饼粉进行水解工艺条件的研究 .实验结果表明 ,原料预处理最佳工艺条件为 :5% HCl,豆饼粉加水比为 1∶ 4,90℃处理 3.5 h;酶解最佳条件为 :每克原料的酶浓度为 60 0 0 u,p H为 3.0 ,温度为 45℃ ,时间为 9h.预处理前过 70目筛 ,加入 2× 1 0 -3mol/ L的Ca Cl2 ,并加以搅拌 ,可使氨基酸态氮生成率达到 70 % ,氨基酸态氮含量达到 0 .9g/ l0 0 m L左右 相似文献